6ª PRÁCTICA

15/10/19
PRÁCTICA Nº 6: "DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE ANTICUERPOS ANTI-BRUCELLA"
Analito: Rosa de Bengala
Método: Aglutinación en porta

PRINCIPIO DEL MÉTODO
El Rosa de Bengala es una técnica de aglutinación en porta para la detección cualitativa y semicuantitativa de anticuerpos anti-Brucella en suero humano. La suspensión bacteriana y coloreada, es aglutinada por anticuerpos IgG o IgM presentes en el suero del paciente.

SIGNIFICADO CLÍNICO
El diagnóstico de la brucelosis puede establecerse bien sea por el aislamiento del microorganismo en sangre o heces, o por la demostración de la presencia de anticuerpos específicos en el suero del paciente. El reactivo, debido a su formulación en un tampón de pH ácido, es capaz de reaccionar con anticuerpos IgG o IgM, por lo que es muy útil para el diagnóstico de individuos en fase crónica de la enfermedad, los cuales presentan un nivel elevado de anticuerpos IgG difícilmente detectables por el método tradicional de aglutinación en tubo (Wright).

REACTIVOS

• Rosa de Bengala: Suspensión de Brucella abortus cepa S99, en Tampón Lactato 1 mol/L, fenol 5 g/L, Rosa de Bengala, pH 3'6.
• Control + (Tapón rojo): Suero animal, con un contenido de anticuerpos anti-Brucella > o igual a 50 UI/mL. Conservante.
• Control - (Tapón azul): Suero animal. Conservante.

MATERIAL NECESARIO

• Bote de orina ("contenedor de desechos").
• Tarjeta.
• Solución Salina Fisiológica (SSF).
• Pipeta automática de 20-200 microlitros.
• Puntas de pipeta amarillas.
  

MUESTRA

• Control + como suero del paciente.

PROCEDIMIENTO
Método cualitativo:

1. Atemperar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente. La sensibilidad del ensayo disminuye a temperaturas bajas.
2. Depositar una gota (50 microlitros) de cada uno de los controles Positivo y Negativo, sobre círculos distintos de la tarjeta.
3. Mezclar el reactivo de Rosa de Bengala vigorosamente antes de usar. A continuación, depositar una gota (50 microlitros) junto a cada una de las dos gotas anteriores de los controles.
   
   
   
   
4. Mezclar las gotas con un palillo, procurando extender la mezcla por toda la superficie interior del círculo.
   Nota: Emplear palillos distintos para cada muestra.
5. Mover el porta con la mano cuidadosamente realizando movimientos circulares con la muñeca durante 4 minutos.
   Nota: El exceso de tiempo puede originar la aparición de falsos positivos.
   
   
   
   
   

Método semicuantitativo:

1. Atemperar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente. La sensibilidad del ensayo disminuye a temperaturas bajas.
2. Depositar 50 microlitros de SSF en todos los círculos de la tarjeta.
3. Echar una gota de control + ("suero del paciente") en el círculo nº1 de la tarjeta. Homogeneizar y transferir 50 microlitros del círculo nº1 al nº2 de la tarjeta. Homogeneizar y transferir 50 microlitros del 2º al 3º círculo de la tarjeta. Este proceso se repite hasta el círculo nº6 de la tarjeta (último), donde se desechan los 50 microlitros sobrantes al bote de orina ("contenedor de desechos").
   Nota: cada vez que homogeneicemos una dilución distinta, emplear puntas de pipeta diferentes, ya que si no lo hacemos pueden aparecer resultado erróneos.
   
4. Añadir una gota (50 microlitros) del reactivo de Rosa de Bengala a cada uno de los círculos de la tarjeta, junto a cada una de las gotas anteriores.
   
5. Mezclar las gotas de cada uno de los círculos con palillos diferentes para cada una de las diluciones, procurando extender la mezcla de cada dilución por toda la superficie interior del círculo.
6. Mover suavemente la tarjeta con la mano realizando movimientos circulares con la muñeca durante un tiempo de 4 minutos. El exceso de tiempo puede originar la aparición de falsos positivos.

RESULTADO
Aunque no se aprecia bien en las siguientes fotos, el título de anti-Brucella ha resultado ser 4, es decir, ha habido presencia de aglutinación hasta el círculo nº2 de la tarjeta, por lo que, el resultado al realizar los cálculo sería el siguiente:
25 x 4 = 100 UI/mL.

LECTURA E INTERPRETACIÓN
Examinar macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación inmediatamente después de agitar la tarjeta con la mano. La presencia de aglutinación indica una concentración de anticuerpos anti-Brucella igual o superior a 25 UI/mL.
En el método semicuantitativo, se define el título como la dilución mayor que da resultado positivo.

CÁLCULOS
La concentración aproximada de anticuerpos anti-Brucella en la muestra del paciente se obtiene de la siguiente manera:
25 x Título de anti-Brucella = UI/mL.

CARACTERÍSTICAS DEL MÉTODO

1. Sensibilidad analítica: 25 (+-5) UI/mL, en las condiciones descritas en el ensayo.
2. Efecto prozona: No se observa efecto prozona hasta valores de 1000 UI/mL.
3. Sensibilidad diagnóstica: 100%.
4. Especificidad diagnóstica: 98%.

NOTAS
El diagnóstico clínico no debe realizarse únicamente con los resultados de un único ensayo, sino que debe considerarse al mismo tiempo los datos clínicos del paciente.