1ª PRÁCTICA

24/09/19
PRÁCTICA 1: "DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE FACTORES REUMATOIDES (FR)"
"FR - Látex (Aglutinación en porta)"

OBJETIVO
Buscar FR en el suero del paciente, que es un anticuerpo frente a la fracción constante de IgG (= Ac-Anti Fc IgG).

PRINCIPIO DEL MÉTODO
El FR-Látex es una técnica de aglutinación en porta para la detección cualitativa, es decir, la presencia o no, y semicuantitativa de factores reumatoides (FR) en suero humano. Las partículas de látex recubiertas con gamma-globulina humana (Ac) son aglutinadas por factores reumatoides presentes en la muestra del paciente.

SIGNIFICADO CLÍNICO
Los factores reumatoides son un grupo de anticuerpos dirigidos contra la fracción constante de las inmunoglobulinas G. Aunque se hallan presentes en un gran número de desordenes reumáticos, tales como el lupus eritematoso sistémico (SLE): que es una enfermedad autoinmunitaria, en la que el sistema inmunitario del cuerpo ataca por error el tejido sano, afectando a la piel, las articulaciones, los riñones, el cerebro y otros órganos; y el síndrome de Sjögren, su principal interés clínico radica en el diagnóstico de la artritis reumatoide (RA): es un trastorno autoinmunitario que ocurre cuando el sistema inmunitario ataca por error los tejidos del cuerpo, y puede afectar de manera significativa las articulaciones. Un estudio actual realizado por el "American College of Rheumatology" demostró que el 80,4% de pacientes con artritis reumatoide fueron positivos para el FR.

REACTIVOS

• Látex: Suspensión de partículas de látex cubiertas con gamma-globulina humana, pH, 8,2. Conservante. Contiene N, N-dimetilformamida.
• Control + (Tapón rojo): Suero humano con una concentración de FR > 30 Ul/mL. Conservante.
• Control - (Tapón azul): Suero animal. Conservante.

PRECAUCIONES
Puede perjudicar la fertilidad o dañar al feto.
Todos los componentes de origen humano han resultado ser negativos para el antígeno HBs, HCV y para el anti-HIV (1/2). Sin embargo, deben tratarse con precaución como potencialmente infecciosos.

CALIBRACIÓN
La sensibilidad del reactivo de FR-látex está estandarizada frente el Patrón Internacional de FR del NIBSC 64/002.

CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD
Todos los componentes del kit están listos para su uso, y son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del vial, cuando se mantienen los viales bien cerrados a 2-8 ºC, y se evita la contaminación durante su uso. No congelar: la congelación de los reactivos altera irreversiblemente la funcionalidad de éstos.
Conservar los viales siempre en posición vertical. En caso de cambio de posición agitar hasta la disolución de posibles agregados.
Indicadores de deterioro de los reactivos: Presencia de partículas y turbidez.

MATERIAL NECESARIO

• Bote de orina desechable: para depositar las puntas de pipeta contaminadas
• Pipeta automática de 10-100 microlitros
• Puntas amarillas
• Tarjetas
• Palillos 
  

MUESTRAS
Suero fresco. Estable 7 días a 2-8ºC o 3 meses a -20ºC.
Las muestras con restos de fibrina deben homogeneizarse por inversión.
No utilizar muestras hemolizadas o lipémicas.

PROCEDIMIENTOS
MÉTODO CUALITATIVO

1. Atemperar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente. La sensibilidad del ensayo disminuye a temperaturas bajas.
2. Depositar 50 microlitros del suero del paciente sobre uno de los círculos de la tarjeta (nº 4) con la ayuda de la pipeta automática y seguidamente desechar la punta en el bote de orina; una gota de control negativo sobre el círculo contiguo al anterior (nº 5), y una gota de control positivo sobre el último círculo de la misma fila (nº 6). 
   
   
   
   
   
   Nota: nos hemos repartido la tarjeta de manera que mi compañera ha realizado la práctica en la primera fila y yo en la segunda.
3. Homogeneizar el reactivo de FR-látex por inversión antes de usarlo. Posteriormente, depositar una gota (50 microlitros) junto a cada una de las gotas anteriores con el cuentagotas que posee el mismo bote.
4. Mezclar las gotas de cada círculo de la tarjeta con un palillo o con las puntas de pipeta amarillas mismamente desechando cada una de ellas cada vez que se mezclen las gotas de uno de los círculos para no contaminarlos entre ellos y por tanto, para no alterar los resultados del paciente y así poder evitar falsos positivos. La mezcla la realizaremos de manera que la extendamos por toda la superficie interior del círculo haciendo un movimiento circulatorio de dentro hacia fuera. 
   
5. Mover la tarjeta con la mano cuidadosamente para no derramar las disoluciones haciendo un ángulo de unos 30º aproximadamente. Agitar durante 2 minutos.
   Nota: El exceso de tiempo puede originar la aparición de falsos positivos.
   
   
   
   

MÉTODO SEMICUANTITATIVO

1. Depositar 50 microlitros de solución salina fisiológica en cada uno de los 6 círculos de la tarjeta con ayuda de la pipeta automática y sus correspondientes puntas amarillas.
2. Verter 50 microlitros del suero del paciente en el círculo nº1 de la tarjeta e ir haciendo a partir de ahí, sucesivas diluciones: el volumen de paso sería 50 microlitros. Antes de pasar 50 microlitros de un círculo a otro de la tarjeta, homogeneizar bien el suero con la solución salina fisiológica mediante pipeteo. De este modo las diluciones serían las siguientes: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64. Desechar los 50 microlitros del círculo nº 6 al bote de orina (de desechos).
3. Echar una gota (50 microlitros) de látex en cada uno de los 6 círculos de la tarjeta.
4. Homogeneizar las gotas con un palillo o puntas de pipeta, procurando extender la muestra por toda la superficie interior del círculo realizando movimientos circulares de dentro hacia fuera (como en el caso anterior).
   Nota:Emplear palillos o puntas distintos para cada muestra.
5. Mover la tarjeta durante 2 minutos. El exceso de tiempo puede originar la aparición de falsos positivos.

LECTURA E INTERPRETACIÓN
Examinar macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación inmediatamente después de haber movido la tarjeta con la mano durante los 2 minutos. La presencia de aglutinación indica una concentración de FR igual o superior a 8 UI/mL.
En el método semicuantitativo, se define el título como la dilución mayor que da resultado positivo, es decir,es la inversa de la máxima dilución de suero que produce aglutinación visible.

CÁLCULOS
La concentración aproximada de FR en la muestra del paciente se obtiene aplicando la siguienten fórmula:
8 x Título de FR = UI/mL
8 x 16 = 128 UI/mL

CONTROL DE CALIDAD
Se recomienda utilizar el control positivo y negativo para controlar la funcionalidad del reactivo de látex, así como modelo de comparación para la interpretación de los resultados.
Todo resultado distinto al resultado que da el control negativo, se considerará positivo.

VALORES DE REFERENCIA
Hasta 8 UI/mL. Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.

CARACTERÍSTICAS DEL MÉTODO

1. Sensibilidad analítica: 8 (6-16) UI/mL, en las condiciones descritas en el ensayo.
2. Efecto prozona: No se observa efecto prozona hasta valores de 1500 UI/mL.
3. Sensibilidad diagnóstica: 100%.
4. Especificidad diagnóstica: 100%.

Tanto la sensibilidad como la especificidad diagnósticas han sido obtenidas comparando 118 muestras con el mismo método de un competidor.

INTERFERENCIAS
Bilirrubina (20 mg/dL), hemoglobina (10 g/L) y lípidos (10 g/L) no interfieren. Otras sustancias pueden interferir.

LIMITACIONES DEL MÉTODO
- La incidencia de resultados falsamente positivos es del 3-5%.
Individuos que padecen otras enfermedades como mononucleosis infecciosa, hepatitis, sífilis, y personas de edad avanzada, pueden dar lugar a resultados positivos falsos.
- Es importante para establecer un buen diagnóstico de la enfermedad, realizar también una prueba de Waaler Rose, junto con el examen clínico del paciente.

NOTAS

1. Los resultados obtenidos con el método de látex no son comparables con los obtenidos mediante el método de Waaler Rose. La diferencia de resultados entre técnicas no refleja diferencias en cuanto a la capacidad de ambas para detectar factores reumatoides.
2. A la hora de homogeneizar las gotas en las tarjetas, se recomienda situar la pipeta automática formando un ángulos de unos 30º para evitar las burbujas de aire.

OBSERVACIONES

• El RF-Látex está caducado desde el 2016.
• La fecha de caducidad del suero del paciente es el 09/2019.
• La presencia de aglutinación nos dará la respuesta a la reacción Ag-Ac formada.

RESULTADO
El resultado del método cualitativo, ha sido positivo, a pesar de las condiciones del RF-Látex.
Mientras que en el método cuantitativo, el título de FR ha sido 16, es decir, ha habido aglutinación hasta el pocillo nº4 de la tarjeta.