2ª PRÁCTICA

01/10/19
PRÁCTICA 2: "DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE FACTORES REUMATOIDES (FR)"
"WAALER ROSE (HEMAGLUTINACIÓN EN PORTA)"

PRINCIPIO DEL MÉTODO
El Waaler Rose es una técnica de hemaglutinación (debido a que esta vez en vez de látex, utilizamos hematíes) en porta para la detección cualitativa y semicuantitativa de FR en suero humano. Los hematíes estabilizados de oveja y sensibilizados con IgG de conejo anti-hematíe de oveja, son aglutinados por FR presentes en la muestra del paciente.

SIGNIFICADO CLÍNICO
Los factores reumatoides son un grupo de anticuerpos dirigidos contra la fracción Fc de las inmunoglobulinas G. Aunque se hallan presentes en un gran número de desordenes reumáticos, tales como el lupus eritematoso sistémico (SLE) y el síndrome de Sjögren, su principal interés clínico radica en el diagnóstico de la artritis reumatoide (RA).
Un estudio actual realizado por el "American College of Rheumatolgy" demostró que el 80,4% de pacientes con artritis reumatoide fueron positivos para el FR.

REACTIVOS
- Waaler Rose: Suspensión hematíes estabilizados de oveja y sensibilizados con IgG de conejo anti-hematíe de oveja, pH, 8,2. Conservante.
- Control + (Tapón rojo): Suero humano con una concentración de FR > 30 UI/mL. Conservante.
Va a aglutinar cuando le echemos la gota.

PRECAUCIONES
Todos los componentes de origen humano han resultado ser negativos para el antígeno HBs, HCV y para el anti-HIV (1/2). Sin embargo, deben tratarse con precaución como potencialmente infecciosos.

CALIBRACIÓN
La sensibilidad del reactivo de WR está estandarizado frente el Calibrador Internacional de FR de OMS (WHO 64/1 Rheumatoid Arthritis Serum).

CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD
Las condiciones de conservación y estabilidad son comunes al protocolo anterior, al igual que los indicadores de deterioro de los reactivos.

MUESTRAS
Suero fresco. Estable 8 días a 2-8ºC o 3 meses a -20ºC.
Las muestras con restos de fibrina deben ser centrifugadas antes de usar. No utilizar muestras altamente hemolizadas o lipémicas.

MATERIAL NECESARIO

• Pipeta automática de 50 microlitros
• Puntas amarillas estériles
• Tarjeta
• Gradilla
• Tubo eppendorf
• Bote de orina: para desechos
• Guantes y bata
  
  
  
  

PROCEDIMIENTO
Método cualitativo

1. Atemperar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente. La sensibilidad del ensayo disminuye a temperaturas bajas.
2. Depositar una gota del control + sobre un círculo de la tarjeta.
   Nota: sólo lo realizaron los alumnos de una de las esquinas de cada fila.
3. Homogeneizar suavemente el reactivo de WR antes de usarlo por inversión. Depositar una gota (50 microlitros) junto a la gota del control +.
4. Mezclar ambas gotas con una punta de pipeta o un palillo, procurando extender la mezcla por toda la superficie interior del círculo.
5. Situar la tarjeta sobre una superficie lisa y plana durante 2 minutos.
6. Inmediatamente después, inclinar la tarjeta unos 45º de la horizontal y dejarlo nuevamente en reposo durante 1 minuto. El exceso de tiempo puede originar la aparición de falsos positivos. 

Método semicuantitativo

1. En primer lugar, el grupo de la primera mesa ha alicuotado el suero del paciente para cada grupo en tubos eppendorf.
2. Depositar 50 microlitros de solución salina fisiológica en cada uno de los 6 círculos de la tarjeta con ayuda de la pipeta automática y sus correspondientes puntas (amarillas).
   
3. Verter 50 microlitros del suero del paciente, contenido en el eppendorf, en el primer círculo de la tarjeta (nº 1) junto a la gota de solución salina fisiológica anterior.
4. Seguidamente mezclar ambas gotas del primer círculo de la tarjeta por pipeteo y realizar diluciones sucesivamente: una vez mezcladas las gotas del primero, coger 50 microlitros de la mezcla resultante y pasarlos al segundo, homogeneizar con la gota de solución salina fisiológica por pipeteo de nuevo y una vez hecho esto, pasar 50 microlitros al tercer círculo de la tarjeta. Este proceso se realiza con los seis círculos de la tarjeta. Al llegar al último círculo de la tarjeta (nº 6) desechar los 50 microlitros del volumen de paso al bote de orina.
   
5. Posteriormente, añadir en cada uno de los 6 círculos, una gota (50 microlitros) del reactivo de WR.
   
   
   Nota: antes de usar el reactivo de WR, homogeneizar suavemente el bote que lo contiene por inversión.
6. Mezclar las gotas con puntas de pipeta diferentes, procurando extender la mezcla por toda la superficie interior del círculo realizando movimientos circulares de dentro hacia fuera.
7. Situar la tarjeta sobre una superficie lisa y plana durante 2 minutos.
   
8. Inmediatamente después, inclinar la tarjeta unos 45º de la horizontal y dejarlo nuevamente en reposo durante 1 minuto. El exceso de tiempo puede originar la aparición de falsos positivos.
   

LECTURA E INTERPRETACIÓN
Examinar macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación inmediatamente después de finalizar la reacción, evitando mover o levantar la tarjeta durante la observación. Nosotros examinamos la tarjeta inclinada unos 45º de la horizontal (la apoyamos en la gradilla mientras la observábamos). La presencia de aglutinación indica una concentración de FR igual o superior a 8 UI/mL. En el método semicuantitativo, se define el título como la inversa de la dilución mayor en la que se aparece una aglutinación visible.

CONTROL DE CALIDAD
Se recomienda utilizar el control positivo y negativo para controlar la funcionalidad del reactivo de látex, así como modelo de comparación para la interpretación de los resultados.

VALORES DE REFERENCIA
Hasta 8 UI/mL. Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.

CARACTERÍSTICAS DEL MÉTODO

1. Sensibilidad analítica: 8 (6-16) UI/mL, en las condiciones descritas en el ensayo.
2. Efecto prozona: No se observa efecto prozona hasta valores de 800 UI/mL.
3. Sensibilidad diagnóstica: 100%.
4. Especificidad diagnóstica: 93,6%.

INTERFERENCIAS
Bilirrubina (20 mg/dL), hemoglobina (10 g/L) y los lípidos (10 g/L) no interfieren. Otras sustancias pueden interferir.

LIMITACIONES DEL MÉTODO
- La incidencia de resultados falsamente positivos es del 3-5%.
Individuos que padecen otras enfermedades como mononucleosis infecciosa, hepatitis, sífilis, y personas de edad avanzada, pueden dar lugar a resultados positivos falsos.
- Es importante para establecer un buen diagnóstico de la enfermedad, realizar también una prueba de FR-Látex, juntamente con el examen clínico del paciente.

NOTAS

1. Los resultados obtenidos con el método de Waaler Rose no son comparables con los obtenidos mediante el método de FR-Látex. La diferencia de resultados entre técnicas no refleja diferencias en cuanto a la capacidad de ambas para detectar factores reumatoides.
2. Como hemos explicado antes, sólo se ha realizado el control + en esta práctica, el negativo no.
3. A la hora de pipetear para mezclar, es recomendable pipetear por un lado de la mezcla para evitar que aparezcan burbujas de aire.
4. Para facilitar la cogida de los 50 microlitros de suero fisiológico, hemos echado el contenido del bote en la tapa del bote de orina y de este modo nos ha resultado más sencillo a la hora de coger la cantidad que se requiere de éste con la pipeta, ya que la boquilla del bote del suero fisiológico es muy estrecha y pequeña.

RESULTADO
Al realizar el método semicuantitativo, el resultado obtenido ha sido negativo, debido a que las condiciones del reactivo eran inadecuadas, y por tanto, no hubo presencia de aglutinación, por lo que no pudimos saber el título.