3ª PRÁCTICA

01/10/19
PRÁCTICA 3: "DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE PROTEÍNA C-REACTIVA (PCR)"
"PCR-LÁTEX (AGLUTINACIÓN EN PORTA)"

PRINCIPIO DEL MÉTODO
La PCR-Látex es una técnica de aglutinación en porta para la detección cualitativa, es decir, si hay presencia o ausencia, y semicuantitativa de PCR en suero humano. Las partículas de látex recubiertas con anticuerpos anti-PCR humana son aglutinadas por moléculas de PCR presentes en la muestra del paciente.

SIGNIFICADO CLÍNICO
La Proteína C-reactiva es una proteína de la fase aguda, presente en el suero de pacientes sanos, la cual puede incrementarse significativamente en la mayoría de los procesos infecciosos bacterianos y virales, tejidos dañados, inflamación y neoplasias malignas. El incremento de concentración de esta proteína se produce después de unas horas de desarrollarse la inflamación pudiendo alcanzar niveles de 300 mg/L en 12-24 horas.

REACTIVOS
- Látex: Suspensión de partículas de látex cubiertas de IgG de cabra anti-PCR humana. pH 8,2. Conservante.
- Control + (Tapón rojo): Suero humano con una concentración de PCR > 20 mg/L. Conservante.

PRECAUCIONES
Todos los componentes de origen humano han resultado ser negativos para el antígeno HBs, HCV y para el anti-HIV (1/2). Sin embargo, deben tratarse con precaución como potencialmente infecciosos.

CALIBRACIÓN
La sensibilidad del reactivo de PCR-látex está estandarizada frente el Material de Referencia ERM-DA 472/IFCC.

CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD
Todos los componentes del kit están listos para el uso, y son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del vial, cuando se mantienen los viales bien cerrados a 2-8ºC, y se evita la contaminación durante su uso. No congelar: la congelación de los reactivos altera irreversiblemente la funcionalidad de éstos.
Conservar los viales siempre en posición vertical. En caso de cambio de posición agitar hasta la disolución de posibles agregados.
Indicadores de deterioro de los reactivos: Presencia de partículas y turbidez. (Todo esto es común a las prácticas anteriores).

MATERIAL NECESARIO

• Pipeta automática de 50 microlitros y sus puntas correspondientes estériles (amarillas).
• Tubos de orina (para desechar las puntas o palillos).
• Gradilla donde hemos situado los tubos eppendorf con el suero del paciente.
• Tarjeta.
  

MUESTRAS
Suero fresco. Estable 7 días a 2-8ºC o 3 meses a -20ºC.
Las muestras con restos de fibrina deben ser centrifugadas antes de la prueba.
No utilizar muestras altamente hemolizadas [la hemólisis (eritrocateresis) es el fenómeno de la desintegración de los eritrocitos (glóbulos rojos o hematíes)] o lipémicas.

PROCEDIMIENTO
Método cualitativo

1. Atemperar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente. La sensibilidad del ensayo disminuye a temperaturas bajas.
2. Depositar 50 microlitros de la muestra a ensayar y una gota de control + sobre círculos distintos de la tarjeta.
   
3. Mezclar el reactivo de PCR-látex vigorosamente antes de usar. Depositar una gota (50 microlitros) junto a cada una de las gotas anteriores.
4. Mezclar las gotas con una punta de pipeta o con un palillo, procurando extender la mezcla por toda la superficie interior del círculo realizando un movimiento circular de dentro hacia fuera del mismo. Emplear puntas de pipeta o palillos distintos para cada muestra.
5. Mover la tarjeta realizando movimientos circulares con la muñeca y mano cuidadosamente durante 2 minutos. El exceso de tiempo puede originar la aparición de falsos positivos.

Método semicuantitativo

1. Como hemos realizado esta práctica seguidamente de la anterior, ya tenemos preparado el suero del paciente en un tupo eppendorf, el cual hemos posicionado en la gradilla.
2. Verter 50 microlitros de suero fisiológico (el cual echamos anteriormente en la tapadera del bote de orina para facilitar su recogida con la pipeta automática) en cada uno de los círculos de la tarjeta.
3. Depositar en el primer círculo de la tarjeta (nº 1) 50 microlitros del suero del paciente.
4. Homogeneizar los 100 microlitros (suero fisiológico + suero del paciente) por pipeteo y a partir de ahí realizar diluciones sucesivas: una vez homogeneizada la mezcla del círculo nº 1 de la tarjeta, coger 50 microlitros y depositarlos en el círculo nº 2, homogeneizar la mezcla de nuevo y volver a pasar 50 microlitros al círculo nº 3 de la tarjeta; realizar este proceso sucesivamente y una vez homogeneizada la mezcla del círculo nº 6, desechar los 50 microlitros restantes al bote de orina. De esta manera, obtendremos las siguientes diluciones: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64.
5. Mezclar el reactivo de PCR-látex vigorosamente antes de usar. Echar una gota (50 microlitros) junto a cada una de las diluciones realizadas anteriormente (en los 6 círculos de la tarjeta).
   
   
   
   
6. Mezclar las gotas del reactivo con cada una de las diluciones con palillos o puntas de pipeta diferentes, procurando extender la mezcla de cada círculo por toda la superficie interior del círculo realizando movimientos circulares de dentro hacia fuera.
   
7. Mover la tarjeta realizando movimientos circulares con la muñeca y mano cuidadosamente durante 2 minutos. El exceso de tiempo puede originar la aparición de falsos positivos.

LECTURA E INTERPRETACIÓN
Examinar macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación inmediatamente después de mover la tarjeta con la mano. La presencia de aglutinación indica una concentración de PCR igual o superior a 6 mg/L.
En el método semicuantitativo, se define el título como la inversa de la dilución mayor en la que es visible la aglutinación.

CÁLCULOS
La concentración aproximada de PCR en la muestra del paciente se obtiene aplicando la siguiente fórmula:
6 x Título de PCR= mg/L
6 x 4= 24 mg/L

CONTROL DE CALIDAD
Se recomienda utilizar el control positivo y negativo para controlar la funcionalidad del reactivo de látex, así como modelo de comparación para la interpretación de los resultados.
Todo resultado distinto al resultado que da el control negativo, se considerará positivo.

VALORES DE REFERENCIA
Hasta 6 mg/L. Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.

CARACTERÍSTICAS DEL MÉTODO

1. Sensibilidad analítica: 6 (5-10) mg/L, en las condiciones descritas en el ensayo.
2. Efecto prozona: No se observa efecto prozona hasta valores de 1600 mg/L.
3. Sensibilidad diagnóstica: 95,6 %.
4. Especificidad diagnóstica: 96,2 %.

INTERFERENCIAS
Bilirrubina (20 mg/dL), hemoglobina (10 g/L) y los lípidos (10 g/L) no interfieren. Factores reumatoides (100 UI/mL), interfieren. Otras sustancias pueden interferir.

NOTAS

1. Una concentración muy elevada de PCR en la muestra del paciente puede dar lugar a un resultado falsamente negativo debido al efecto prozona. Se recomienda re-ensayar la muestra utilizando un volumen de 20 microlitros.
2. La intensidad de la aglutinación no es indicativa de la concentración de PCR en las muestras ensayadas.
3. El diagnóstico clínico no debe realizarse únicamente con los resultados de un único ensayo, sino que debe considerarse al mismo tiempo los datos clínicos del paciente.

OBSERVACIONES
- No se ha realizado el control negativo.

RESULTADO
El resultado de esta práctica ha sido positivo y hemos visualizado aglutinación (como consecuencia de la reacción Ag-Ac) hasta el círculo nº 2 de la tarjeta, por lo que el título de PCR ha sido 4.