4ª PRÁCTICA

15/10/19
PRÁCTICA Nº 4: "SERODIAGNÓSTICO DE LA TOXOPLASMOSIS POR HEMOAGLUTINACIÓN INDIRECTA"

OBJETIVO

• Determinación cuantitativa de anticuerpos séricos dirigidos contra Toxoplasma gondii por hemoaglutinación indirecta.

PRINCIPIO DEL MÉTODO
Se basa en el principio de la hemoaglutinación indirecta. Los hematíes sensibilizados están constituidos por hematíes de ovino recubiertos por un antígeno toxoplasmático. Esta técnica permite detectar las IgG y las IgM anti-toxoplasmáticas. Es posible diferenciarlos tratando el suero con 2-mercaptoetanol (2-ME) el cual inhibe el poder aglutinante de las IgM.
La presencia de anticuerpos anti-Toxoplasma gondii séricos provoca una aglutinación de los hematíes sensibilizados que se traduce en un velo rojo/marrón que tapiza el pocillo. En ausencia de anticuerpos específicos, estos hematíes se sedimentan en el fondo del pocillo como un anillo.
Los hematíes no sensibilizados aseguran la especificidad de la reacción y permiten eliminar las interferencias debidas a las aglutininas naturales anti-ovino (heteroanticuerpos de Forssman, anticuerpos de la mononucleosis infecciosa ...).
La reacción se efectúa en microplaca con fondo en U.
La manipulación es simple y rápida. Los resultados se obtienen en 2 horas.

COMPOSICIÓN DEL EQUIPO

• Hematíes sensibilizados (origen animal).
• Hematíes no sensibilizados (origen animal).
• Tampón fosfato pH 7'2.
• Adsorbente (origen animal).
• Control positivo titulado (origen animal).
• Control negativo (origen animal).
• 2 microplacas con fondo en U.
• 2 cuenta-gotas especiales para dispensar alrededor de 16 microlitros.

Observación: Utilizar el cuenta-gotas rojo para los hematíes sensibilizados y el cuenta-gotas verde para los hematíes no sensibilizados.

MATERIAL NECESARIO

• Bote de orina ("contenedor de desechos").
• Pipeta automática de 10-100 microlitros.
• Puntas de pipeta amarillas.
• 2 gradillas.
• Pipeta graduada de 1 mL con auxiliar de pipeteado azul.
• Placa microtiter con fondo en U.
• 2 tubos de ensayo de 3 mL cada uno (1mL de TAMPÓN en cada uno de ellos).
• Tubo de ensayo con el suero del paciente.
• Tubo de ensayo de 3mL: 1'95 mL de Tampón + 50 microlitros del suero = 2 mL.
• Papel Parafilm.
  

REACTIVOS

• R1: Hematíes sensibilizados.
• R2: Hematíes no sensibilizados.
• R3: Adsorbente.

ALMACENAMIENTO DE LOS REACTIVOS
Deben ser almacenados a 2-8ºC, hasta la fecha de caducidad indicada en el estuche. No congelar.

PRECAUCIONES DE USO
- Para uso in vitro.
- No utilizar reactivos ni controles provenientes de lotes diferentes.
- Dejar que los reactivos y las muestras alcancen la temperatura ambiente antes de efectuar la prueba.
- Agitar cuidadosamente las suspensiones de hematíes antes del uso.
- Al dispensar las suspensiones de hematíes, asegurarse que el cuenta-gotas esté perfectamente vertical. Verificar la ausencia de burbujas de aire en las gotas, con el fin de que los volúmenes dispensados sean constantes.
- Los sueros, los reactivos, así como el material y los productos contaminados deben ser eliminados en un contenedor para desechos contaminados, según las recomendaciones y la reglamentación en vigor.
- Todos los reactivos, salvo el tampón fosfato, contienen material de origen animal. Deben ser considerados como potencialmente infecciosos y manipulados con precaución.

PROCEDIMIENTO DEL ANÁLISIS
Dejar que los reactivos y los sueros alcancen la temperatura ambiente antes de su uso.
- Análisis de las inmunoglobulinas totales:

1. En primer lugar,  procederemos a preparar una dilución madre (1/40): para ello, hay que distribuir en un tubo para hemólisis y mezclar 50 microlitros de suero + 1'95 mL tampón.
   
2. Realización de la prueba en microplaca en U:

a) Con la ayuda de la micropipeta multicanal de 10-100 microlitros, ajustarla a los 50 microlitros y depositar tampón fosfato en 8 pocillos de la microplaca (1ª fila de la placa).

b) Dispensar 50 microlitros de solución madre 1/40 preparada anteriormente en el primer pocillo de la primera fila de la microplaca.

Homogeneizar la disolución de la solución madre + solución tampón por pipeteo y transferir 50 microlitros del primer pocillo a segundo. Desechar la punta de pipeta y coger una nueva. Homogeneizar la disolución del 2º pocillo y transferir 50 microlitros de éste al tercer pocillo. Volver a desechar la punta de pipeta y coger una nueva. Mezclar la disolución del tercer pocillo y transferir 50 microlitros al 4º pocillo. Este proceso se repite sucesivamente hasta llegar al 6º pocillo, donde homogeneizaremos y desecharemos 50 microlitros al bote de orina.

c) Dispensar 50 microlitros de la solución madre en el 7º pocillo. Resuspender y desecharlos al tubo de orina.
Nota: Esta dilución, constituye el suero control, cuyo papel es detectar las aglutininas naturales anti-ovino que pueden contener ciertos sueros.
d) A continuación, agitar cuidadosamente las suspensiones de hematíes.
Depositar 1 gota de hematíes sensibilizados (R1) con el cuenta-gotas rojo en los 6 primeros pocillos.
Posteriormente, depositar otra gota de hematíes sensibilizados en el 8º pocillo (reactivo control).
Nota: El papel del reactivo control es controlar la validez del tampón y de los hematíes sensibilizados.

e) Por último, depositar 1 gota de hematíes no sensibilizados con el cuenta-gotas verde en el 7º pocillo (suero control).

f) Homogeneizar muy cuidadosamente el contenido de los pocillos manualmente, golpeando lateralmente la microplaca, manteniéndola plana. Dejar la placa inmóvil sobre la mesa y taparla con papel Parafilm.

g) Leer la reacción 2 horas más tarde.

RESULTADOS
El suero del paciente es positivo hasta la dilución 1/1280, es decir, hasta el pocillo nº 5 de la placa microtiter, donde el umbral de sensibilidad es de 0'1 UI/mL, el título de este suero será entonces de 1280 x 0'1 = 128 UI/mL.

NOTAS

1. Cuando se realiza la titulación del suero del paciente por aglutinación en ausencia de 2-ME y se informa un título, en realidad se está informando una actividad aglutinante que es la suma de la actividad aglutinante de la IgM y de la IgG. (Como es el caso de esta práctica).
2. Si se realiza la técnica en presencia de 2-ME se produce una reducción de la IgM. El título que se obtiene al realizar la técnica de aglutinación en presencia de 2-ME corresponderá exclusivamente a la actividad aglutinante de la IgG.
3. El suero control (dilución 1/80) debe dar una reacción negativa (anillo).
4. El reactivo control, controla la validez del tampón y de los hematíes sensibilizados. Debe dar una reacción negativa.
5. Todo el procedimiento sólo se ha realizado en la 1ª fila de la microplaca.
6. Para proceder a la realización de esta práctica hemos hecho 13 grupos: un grupo por cada 2 personas.
7. Los controles + y - no lo hemos hecho.
8. Las diluciones de los pocillos de la placa serían las siguientes:

1) 1/80 2) 1/160 3)1/320 4)1/640 5)1/1280 6)1/2560 7) Suero control 8) Reactivo control

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Reacción dudosa:
1/80 < o igual al Título < 1/160
Presencia de anticuerpos anti-toxoplasma a título libre.
- Examen de cribado: interpretable en función de los resultados de la combinación de diferentes técnicas de serología toxoplasmática practicadas al suero. Controlar si es necesario mediante una nueva muestra.
- Examen de seguimiento de una mujer encinta conocida como no inmunizada o examen efectuado en caso de sospecha de infección reciente: posible toxoplasmosis aguda.
Una investigación de IgM debe ser realizada.
Se recomienda hacer un control con una nueva muestra efectuado 15 a 21 días más tarde.