8ª PRÁCTICA
29/10/19
PRÁCTICA Nº8: "DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE ANTICUERPOS ANTI-TREPONEMA PALLIDUM"
Analito: TPHA
Método: Hemaglutinación en microplaca
PRINCIPIO DEL MÉTODO
TPHA (Treponema Pallidum Haemagglutination) es una prueba de hemoaglutinación indirecta en microplaca para la detección cualitativa y semicuantitativa de anticuerpos específicos anti-Treponema pallidum en suero humano. Los hematíes de ave estabilizados y sensibilizados con una solución antigénica de T. pallidum, aglutinan en presencia de anticuerpos anti-T.pallidum mostrando unos patrones de aglutinación característicos.
SIGNIFICADO CLÍNICO
La sífilis es una enfermedad venérea provocada por la infección con T. pallidum. La transmisión del microorganismo se produce por contacto directo a través de una lesión productiva. El periodo de incubación es aproximadamente de 20 días y la enfermedad progresa a través de 3 fases distintas con sintomatología diferente. Los anticuerpos anti-Treponema aparecen a partir de la primera fase y pueden permanecer en un 85-90% de pacientes tratados a pesar de haber superado la enfermedad.
REACTIVOS
Todos los componentes de origen humano han resultado ser negativos para el antígeno HBs, HCV y para el anti-HIV (1/2). Sin embargo, deben tratarse con precaución como potencialmente infecciosos.
MATERIAL NECESARIO
Método cualitativo:
Lo hemos realizado en la 1ª fila de la placa de microtitulación.
Lo hemos realizado en la 2ª fila de la placa de microtitulación.
Los resultados deben ser leídos comparando los patrones de aglutinación de las Células Test con los de las Células Control (Nota 3). Los resultados se evalúan de acuerdo con los siguientes criterios:
El Control Negativo no debe mostrar aglutinación con Células Test ni con Células Control.
El Control Positivo solo debe mostrar aglutinación con las Células Test.
Cualquier aglutinación mostrada con las Células Control, indica la presencia de anticuerpos inespecíficos y no debe interpretarse.
Las muestras con resultado límite deben ser reensayadas e interpretadas como negativas si se produce el mismo patrón de aglutinación.
Las muestras positivas deben ser tituladas según el procedimiento semicuantitativo.
El diagnóstico clínico no debe realizarse únicamente con los resultados de un único ensayo, sino que debe considerarse al mismo tiempo los datos clínicos del paciente.
RESULTADOS
CARACTERÍSTICAS DEL MÉTODO
Bilirrubina (20mg/L), hemoglobina (10 g/L), lípidos (10 g/L) y factores reumatoides (300 UI/mL), no interfieren.
NOTAS
- El ensayo de TPHA presenta determinadas inespecificidades con anticuerpos de otras especies de treponemas patógenos. Es recomendable que todos los resultados positivos se confirmen con técnicas alternativas como FTA-Abs.
- Se han descrito reacciones falsamente positivas en muestras de pacientes con mononucleosis, lepra, borreliosis, enfermedades autoinmunes y drogadicción.
- La prueba de TPHA no es útil para controlar la eficacia del tratamiento, ya que el nivel de anticuerpos permanece mucho tiempo después de la curación de la enfermedad.
PRÁCTICA Nº8: "DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE ANTICUERPOS ANTI-TREPONEMA PALLIDUM"
Analito: TPHA
Método: Hemaglutinación en microplaca
PRINCIPIO DEL MÉTODO
TPHA (Treponema Pallidum Haemagglutination) es una prueba de hemoaglutinación indirecta en microplaca para la detección cualitativa y semicuantitativa de anticuerpos específicos anti-Treponema pallidum en suero humano. Los hematíes de ave estabilizados y sensibilizados con una solución antigénica de T. pallidum, aglutinan en presencia de anticuerpos anti-T.pallidum mostrando unos patrones de aglutinación característicos.
SIGNIFICADO CLÍNICO
La sífilis es una enfermedad venérea provocada por la infección con T. pallidum. La transmisión del microorganismo se produce por contacto directo a través de una lesión productiva. El periodo de incubación es aproximadamente de 20 días y la enfermedad progresa a través de 3 fases distintas con sintomatología diferente. Los anticuerpos anti-Treponema aparecen a partir de la primera fase y pueden permanecer en un 85-90% de pacientes tratados a pesar de haber superado la enfermedad.
REACTIVOS
- R1 Células Test (TC): Hematíes de ave estabilizados y sensibilizados con antígenos de T.pallidum (Nichols). Conservante, pH 7'2.
- R2 Células Control (CC): Suspensión estabilizada de hematíes de ave. Conservante, pH 7'2.
- R3 Diluyente (DIL): Tampón fosfato, extracto de T.pallidum (Reiter), Conservante. pH 7'2.
- Control +: Suero inmune humano prediluido 1:20. Conservante.
- Control - : Suero de animal, Conservante.
Todos los componentes de origen humano han resultado ser negativos para el antígeno HBs, HCV y para el anti-HIV (1/2). Sin embargo, deben tratarse con precaución como potencialmente infecciosos.
MATERIAL NECESARIO
- Placa de microtitulación con fondo en "U".
- Pipeta automática de 20-200 microlitros.
- Bote de orina ("contenedor de desechos").
- Puntas de pipeta amarillas.
- Papel Parafilm.
- Suero del paciente diluido al 1/20.
Método cualitativo:
Lo hemos realizado en la 1ª fila de la placa de microtitulación.
- Atemperar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente.
- Preparar una dilución 1:20 de la muestra en Diluyente (10 microlitros de suero + 190 microlitros Diluyente).
- Pipetear en pocillos adyacentes de una placa de microtitulación (Nota 1):
- Dispensar 25 microlitros de la muestra diluida al 1/20 en 2 pocillos de la placa.
- A continuación, echar 75 microlitros de Células Control en el primer pocillo.
- Posteriormente, depositar 75 microlitros de Células Test en el 2º pocillo.
Lo hemos realizado en la 2ª fila de la placa de microtitulación.
- Dispensar 25 microlitros de Diluyente (R3) en cada uno de los 4 pocillos primeros de la fila de la placa microtiter.
- Depositar 25 microlitros de la muestra diluida al 1/20 (Control +) en el primer pocillo. Homogeneizar y transferir 25 microlitros del primer pocillo al 2º pocillo. Repetir el proceso hasta el pocillo nº4, en el que homogeneizaremos y desecharemos los 25 microlitros sobrantes al bote de orina. De esta forma, obtendremos diluciones de: 1/40, 1/80, 1/160, 1/320.
Nota: utilizar puntas de pipeta distintas a la hora de homogeneizar y pasar las diferentes diluciones de un pocillo a otro, ya que si utilizamos la misma punta de pipeta se alterarían los resultados: erróneos. - Por último, echar 75 microlitros de Células Control (R2) en cada uno de los 4 pocillos.
- Agitar suavemente la placa hasta la completa homogeneización de las mezclas.
- Cubrir la placa con papel Parafilm e incubar a temperatura ambiente durante 45-60 min (Nota 2).
- Examinar macroscópicamente los patrones de aglutinación de las células.
Los resultados deben ser leídos comparando los patrones de aglutinación de las Células Test con los de las Células Control (Nota 3). Los resultados se evalúan de acuerdo con los siguientes criterios:
| Grado de Aglutinación | Lectura | Resultado | |
| Capa de células lisas que recubre por completo el fondo del pocillo,algunas veces con los bordes replegados | 4 + | Reactivo | |
| Capa de células cubriendo parte del fondo del pocillo | 3 + | Reactivo | |
| Capa de células rodeada por un círculo rojo | 2 + | Reactivo | |
| Capa de células cubriendo menos área y rodeadas por un círculo rojo | 1 + | Reactivo | |
| Botón de células con un pequeño orificio en el centro | ± | Límite | |
| Botón compacto y definido de células, a veces con un pequeño orificio en el centro | - | Negativo |
El Control Negativo no debe mostrar aglutinación con Células Test ni con Células Control.
El Control Positivo solo debe mostrar aglutinación con las Células Test.
Cualquier aglutinación mostrada con las Células Control, indica la presencia de anticuerpos inespecíficos y no debe interpretarse.
Las muestras con resultado límite deben ser reensayadas e interpretadas como negativas si se produce el mismo patrón de aglutinación.
Las muestras positivas deben ser tituladas según el procedimiento semicuantitativo.
El diagnóstico clínico no debe realizarse únicamente con los resultados de un único ensayo, sino que debe considerarse al mismo tiempo los datos clínicos del paciente.
RESULTADOS
- 1ª fila (método cualitativo):
- Primer pocillo: Negativo -
- Segundo pocillo: Reactivo 1+
- 2ª fila (método semicuantitativo):
- Primer pocillo: Límite ±
- Segundo pocillo: Negativo -
- Tercer pocillo: Negativo -
- Cuarto pocillo: Reactivo 1+
CARACTERÍSTICAS DEL MÉTODO
- Sensibilidad analítica: 0'05 IU/mL frente al primer Patrón Internacional de plasma sifilítica humana IgG e IgM.
- Efecto prozona: No se observa efecto prozona hasta títulos mayores o iguales a 1/163840 (Nota 4).
- Sensibilidad diagnóstica: 99'5%.
- Especificidad diagnóstica: 100%.
Bilirrubina (20mg/L), hemoglobina (10 g/L), lípidos (10 g/L) y factores reumatoides (300 UI/mL), no interfieren.
NOTAS
- Mezclar vigorosamente los viales de Células Test y Control inmediatamente antes de usar.
- Mantener la microplaca alejada de fuentes de vibración, calor y luz solar directa.
- El patrón de aglutinación de las Células Control no debe tomarse como modelo para la interpretación de resultados negativos, ya éstas producen botones más compactos que con las Células Test.
- Los sueros con elevado título de anticuerpos pueden mostrar patrones de aglutinación con los bordes muy replegados.
- El ensayo de TPHA presenta determinadas inespecificidades con anticuerpos de otras especies de treponemas patógenos. Es recomendable que todos los resultados positivos se confirmen con técnicas alternativas como FTA-Abs.
- Se han descrito reacciones falsamente positivas en muestras de pacientes con mononucleosis, lepra, borreliosis, enfermedades autoinmunes y drogadicción.
- La prueba de TPHA no es útil para controlar la eficacia del tratamiento, ya que el nivel de anticuerpos permanece mucho tiempo después de la curación de la enfermedad.
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