9ª PRÁCTICA

 29/10/19
PRÁCTICA Nº 9: "DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE ANTICUERPOS FEBRILES"
Analito: Antígenos Bacterianos
Método: Aglutinación en porta y tubo

PRINCIPIO DEL MÉTODO
Los Antígenos Bacterianos son una técnica de aglutinación en porta y tubo para la detección y semicuantificación de anticuerpos anti-Salmonella, Brucella y Proteus en suero humano. Los reactivos, suspensiones bacterianas, coloreadas y estandarizadas, aglutinan en presencia del anticuerpo homologo correspondiente en las muestras ensayadas.

SIGNIFICADO CLÍNICO
El diagnóstico de enfermedades febriles puede establecerse bien sea por el aislamiento del microorganismo en sangre, orina o heces o por la demostración del título de anticuerpos específicos, somáticos (O) y flagelares (H) en el suero del paciente. La determinación de estos anticuerpos forma las bases para el ensayo de Widal que establece que altos niveles de anticuerpos O y H superiores a 1/100 en suero, es indicativo de infección por estos microorganismos.

REACTIVOS

• Proteus OX19: Ag somático, 5mL.
• Proteus C+: 1mL

COMPOSICIÓN DE LOS REACTIVOS
- Antígenos Bacterianos: Suspensión de Salmonellas, Brucellas y Proteus en tampón glicina, pH 8'2.
- Controles: Suero animal.

CALIBRACIÓN
No existe referencia internacional para la estandarización de la sensibilidad de estos reactivos, por lo que se utiliza un control interno constituido por suero animal que contiene anticuerpos frente a cada uno de los antígenos citados anteriormente y que ha sido titulado con reactivos comerciales de calidad reconocida.

PREPARACIÓN Y ESTABILIDAD
Antígenos Bacterianos: Listos para el uso. Agitar suavemente antes de usar.
Controles: Listos para el uso.

MATERIAL NECESARIO

• Gradilla.
• 6 tubos de ensayo de 3mL.
• Pipeta automática de 100-1000 microlitros.
• Puntas de pipeta azules.
• Vaso de precipitados.
• Cloruro sódico (ClNa).
• Bote de orina ("contenedor de desechos").

MUESTRA

• Suero del paciente.

PROCEDIMIENTO
Método de aglutinación en tubo (semicuantificación):

1. Preparar 6 tubos de ensayo de 3 mL cada uno y rotularlos como "1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320, 1/640".
2. Dispensar en el primer tubo (1/20), 1'9 mL de ClNa (contenido en el vaso de precipitados) y 100 microlitros del suero del paciente (Proteus C+).
   
   
   
   
   
   
   
3. A continuación, depositar 1 mL de ClNa en los otros 5 tubos.
   
4. Homogeneizar el primer tubo y transferir 1 mL (1000 microlitros) de éste al 2º (1/40). Desechar la punta de pipeta, homogeneizar la disolución del 2º tubo y transferir de éste al tercer tubo otro mililitro. Repetir este proceso hasta llegar al 6º tubo, donde homogeneizaremos la mezcla y se desechará el mililitro sobrante al bote de orina ("contenedor de desechos").
5. Añadir una gota (50 microlitros) de antígeno a cada tubo.
   
   
   
   
   
   
   
6. Agitar e incubar los tubos a 37ºC durante 24 h.

RESULTADOS
No hemos podido observar macroscópicamente ninguna aglutinación.

VALORES DE REFERENCIA
Son indicativos de infección reciente:
- Salmonellas: Títulos > o iguales a 1/80 (Ac somáticos) y > o iguales a 1/160 (Ac flagelares).
- Brucellas: Títulos > o iguales a 1/80.
- Proteus: Títulos de OX19 > o iguales a 1/80.
El nivel normal de anticuerpos febriles varía ampliamente según los diferentes países y comunidades. Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.

CARACTERÍSTICAS DEL MÉTODO
Todas las características diagnósticas de los distintos reactivos de Antígenos Bacterianos pueden encontrarse en los correspondientes informes Técnicos que se encuentran a disposición del usuario que los solicite.

LIMITACIONES DEL MÉTODO
- Las infecciones recientes, la inmunodepresión, el efecto prozona (Brucelosis) y la terapia con antibióticos (somáticos), pueden ocasionar falsas negatividades.
- Se han descrito reacciones cruzadas con Brucella en casos de infección o vacunación con algunas cepas de Vibrio cholerae, Pasteurella, Proteus OX19 y Y. enterocolitica.
- Una elevada proporción de individuos normales da resultados positivos con los antígenos de Proteus, especialmente en el ensayo de aglutinación en porta. Un título inferior a 1/160 en tubo, no debe considerarse significativo.

NOTAS

1. En los ensayos de anticuerpos anti-Brucella, se recomienda reducir la muestra a 20 microlitros para evitar el efecto prozona.
2. En determinadas áreas geográficas, con elevada prevalencia de enfermedades febriles, se recomienda diluir la muestra 1/4 en ClNa 9 g/L antes de realizar el ensayo en porta.
3. Se puede acelerar los tiempos de incubación de la siguiente manera:
   Antígenos somáticos (O) y Proteus: 48-50ºC, 4h.
   Antígenos flagelares (H): 48-50ºC, 2 h
4. Un resultado positivo aislado es menos significativo que una variación de títulos obtenidos en ensayos realizados a distintos intervalos de tiempo. El diagnóstico clínico no debe realizarse únicamente con los resultados del laboratorio, sino que debe considerarse al mismo tiempo los datos clínicos del paciente.
5. La aglutinación somática se caracteriza por ser fina y granular, de formación lenta y difícilmente desgregable. La aglutinación flagelar es algodonosa, de formación rápida y fácilmente disgregable.