10ª PRÁCTICA

19/11/19
PRÁCTICA Nº 10: "DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE INMUNOGLOBULINA M (IgM)"
Analito: Inmunoglobulina M
Método: Turbidimetría

PRINCIPIO DEL MÉTODO
Los anticuerpos anti-IgM forman compuestos insolubles cuando se combinan con la IgM de la muestra del paciente, ocasionando un cambio de absorbancia proporcional a la concentración de IgM en la muestra, y que puede ser cuantificada por comparación con un calibrador de IgM de concentración conocida.

SIGNIFICADO CLÍNICO
La IgM es la única inmunoglobulina que sintetiza el recién nacido. En adultos representa el 5-10% del total de inmunoglobulinas. Su estructura es pentamérica y su elevado peso molecular evita su paso a espacios extravasculares.
Su concentración se halla disminuida en enfermedades relacionadas con deficiencias hereditarias o adquiridas de la producción de inmunoglobulinas.
La respuesta normal a las infecciones consiste en aumentar la producción de inmunoglobulinas. La IgM generalmente aumenta en infecciones víricas e infecciones del torrente circulatorio como la malaria y la cirrosis biliar primaria. En caso de mieloma múltiple, si la paraproteína es una IgM, probablemente se trata de una macroglobulinemia de Waldenström. Las crioglobulinemias de origen monoclonal, son generalmente debidas a IgM.

REACTIVOS

• Diluyente (R1): Tampón tris 20 mmol/L, PEG 8000, pH 8'3. Azida sódica 0'95 g/L.
• Anticuerpo (R2): Suero de cabra, anti-IgM humana, pH 7'5. Azida sódica 0'95 g/L.

MATERIAL NECESARIO

• Pipeta automática de 20-200 microlitros.
• Pipeta automática de 10 microlitros.
• Puntas amarillas de pipeta.
• Pipeta automática de 100-1000 microlitros.
• 12 tubos de ensayo de 3 mL cada uno de ellos (6 tubos por cada batería de dilución).
• Gradilla.
• Bote de orina ("contenedor de desechos").
• Solución Salina Fisiológica (SSF).
• Colorímetro para medir las Absorbancias (A) de cada dilución de las baterías.
• Cubetas de fotometría.
• Tapones para tubos de ensayo blancos.
  

PREPARACIÓN
- Reactivos: listos para el uso.
- Curva de calibración: Preparar las siguientes diluciones del Calibrador PROT CAL en ClNa 9 g/L como diluyente. Para obtener las concentraciones de cada dilución de IgM, multiplicar la concentración de IgM del calibrador por el factor correspondiente.

1. Preparar 6 tubos de 3 mL cada uno en una gradilla y rotularlos con los números "1, 2, 3, 4, 5, y 6".
2. En el primer tubo, dispensar 100 microlitros de ClNa o Solución Salina Fisiológica (SSF).
3. En el 2º tubo, echar 90 microlitros de SSF y 10 microlitros del calibrador.
   
   
   
   
   
4. En el tercer tubo, depositar 75 microlitros de SSF y 25 microlitros del calibrador.
   
5. En el 4º tubo, dispensar 50 microlitros de SSF y 50 microlitros del calibrador.
6. En el 5º tubo, echar 25 microlitros de SSF y 75 microlitros del calibrador.
7. En el 6º tubo, depositar 100 microlitros del calibrador.
   Nota: De esta manera, obtendremos los siguientes factores de dilución: 0, 0'1, 0'25, 0'5, 0'75, 1'0 respectivamente de cada tubo.

MUESTRA

• Plasma del paciente.

PROCEDIMIENTO

1. En primer lugar, encender el colorímetro (ya que suele tardar en calentarse) y ajustarlo a 0 frente a agua destilada.
2. Una vez preparadas las diluciones anteriores, preparar otros 6 tubos de 3 mL cada uno en la gradilla:
1.  Coger 10 microlitros de cada uno de los 6 tubos diluidos anteriormente y añadirle a cada uno de los 6 tubos 800 microlitros del Reactivo R1, es decir, depositar 10 microlitros del tubo nº 1 de la batería de dilución anterior en el primer tubo de la nueva batería de diluciones.
2. 10 microlitros de la dilución del tubo nº2 de la batería anterior al 2º tubo de la nueva batería.
3. 10 microlitros del tubo nº3 de la batería previamente realizada en el tubo nº3 de la nueva batería.
4. Repetir este proceso hasta el tubo nº6.
3. A continuación, añadirle a cada uno de los 6 tubos con los 10 microlitros de las diluciones anteriores, 800 microlitros del Diluyente.
   
4. Homogeneizar cada uno de ellos por pipeteo empleando puntas de pipeta distintas para cada dilución.
5. Leer la absorbancia (A1) después de la adición de la muestra de cada uno de los tubos de la nueva batería.
   
   
   
   
   
   
6. Inmediatamente después, pipetear en cada tubo 200 microlitros del Reactivo R2 (Anticuerpo).
   
7. Mezclar y leer la absorbancia (A2) exactamente después de 2 minutos de añadir el reactivo R2.
8. Posteriormente, coger 1 tubo por persona, echar 800 microlitros de R1 y 10 microlitros del plasma .
9. Medir la absorbancia (A1).
10. Posteriormente, depositar en el mismo tubo 200 microlitros de R2 (Anticuerpo) y medir la A2 después de 2 minutos de añadir el reactivo R2.

CÁLCULOS
Calcular la diferencia de absorbancias (A2-A1) obtenidas para los distintos calibradores, y construir la curva de calibración de los valores obtenidos frente a las concentraciones de IgM de cada dilución del Calibrador. La concentración de IgM en la muestra se calcula por interpolación de su diferencia (A2-A1) en la curva de calibración.

RESULTADOS
Muestra de plasma:

• 800 microlitros de R1 + 10 microlitros del plasma (A1): 0'246 A.
• 800 microlitros de R1 + 10 microlitros del plasma + 200 microlitros de R2 (A2): 0'515 A.

- Cálculos:
A2 - A1: 0'515 A - 0'269 A= 0'246 A

Batería de diluciones:

• Tubo 1 : A2 -  A1 = 0'241 A - 0'214 A= 0'027 A.
• Tubo 2: 0'316 A - 0'219 A= 0'097 A.
• Tubo 3: 0'467A - 0'224 A= 0'243 A.
• Tubo 4: 0'580 A - 0'251 A= 0'329 A.
• Tubo 5: 0'703 A - 0'275 A= 0'428 A.
• Tubo 6: 1'341 A - 0'289 A = 1'052 A.

- Sabiendo que la concentración del calibrador IgM es 259 mg/dL.
Concentraciones de los tubos de la batería de diluciones:

• Tubo 1: 0 mg/dL.
• Tubo 2: 25'9 mg/dL.
• Tubo 3: 64'75 mg/dL.
• Tubo 4: 129'5 mg/dL.
• Tubo 5: 194'25 mg/dL.
• Tubo 6: 259 mg/dL.

VALORES DE REFERENCIA
Entre 40-230 mg/dL.

CARACTERÍSTICAS DEL MÉTODO

1. Rango de medida: hasta 300 mg/dL en las condiciones descritas del ensayo. Las muestras con valores superiores deben diluirse 1/5 con ClNa y ensayarse de nuevo. El intervalo de medida depende de la relación muestra/reactivo. Disminuyendo el volumen de muestra, se aumenta el límite superior del intervalo de medida, aunque se reduce la sensibilidad.
2. Límite de detección: valores por debajo de 1 mg/dL dan lugar a resultados poco reproducibles.
3. Sensibilidad:  2'4 mg/dL.
4. Efecto prozona: no se observa hasta valores de > 2000 mg/dL.
5. Precisión: El reactivo ha sido probado durante 20 días con dos niveles diferentes de suero.
6. Exactitud: El comportamiento de este método se comparó con el método Elecsys de Roche. 100 muestras de concentraciones de IgM entre 50 y 210 mg/dL fueron analizadas con ambos métodos.

INTERFERENCIAS
- Los factores reumatoides pueden interferir a concentraciones superiores a 900 UI/mL.

NOTAS

1. El diagnóstico clínico no debe realizarse únicamente con los resultados de un único ensayo, sino que debe considerarse al mismo tiempo los datos clínicos del paciente.

OBSERVACIONES
- La medición de las absorbancias (A) de la primera batería de dilución, corresponden a absorbancias sin anticuerpos, sólo con IgM del calibrador.
- El calibrador de proteínas está caducado desde 2016.